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        光学相衬观察法-物理背景和应用领域

        浏览次数: 日期:2016年1月8日 14:04

        在生物显微镜帮助下,运用光学相衬观察法,能够轻松实现对活体细胞和无色样本的检测。不同的显微镜技术旨在通过光的作用实现相移改变,同时,由于亮度差使振幅移位中的样本肉眼可见

        图 1:振幅物体和相位物体。上一列:当光线穿过所谓的振幅物体(红盒子)时,光波的振幅 (A) 会降低 (ΔA)。肉眼将其辨认为亮度损失。中间列:在所谓的相位物体中,穿过物体的光束通道会导致光波发生相移 (Δϕ),这是肉眼看不到的。下一列:未变化的光波。

        观察活体标本面临的挑战

        明场显微镜检查通常只能提供未染色样本的微弱成像,用户只能看到几个细节。高对比度是查看图像更多细节的重要因素。提高对比度的方法之一就是,将样本染色。然而这对于活体生物来说是不可能实现的,因此,这些活体生物只能保持无色,因此,它们看起来并不显眼。实际上,这些样本也会与光学显微镜发出的入射光互相作用。然而,肉眼却看不到因此发生的相移。肉眼只能看到振幅(亮度)和频率(颜色)发生变化。

        对比度指的是区分样本和背景的可能性,从而观察样本的细节。它被定义为图像与相邻背景(相对于整个背景强度而言)之间的光强差。这些差别至少达到两个百分比以上才能被肉眼观察到。运用光检测器,能够在很大程度上改善这一状况。

        但是,对比度不仅由样本决定,而且还由其与光发生的作用所决定。用于观察样本的光学系统,及其记录图像信息的功能同样重要。在微观系统中,对比度取决于适当的孔径设定值、光学像差等级、所用的相衬观察法、样本以及检测器。

        由于更改光阑的孔径设定值,因此,通过光学显微镜获取的图像对比度不会受到相衬观察法的影响。但是,如果聚光镜的孔径缩小过多,那么,分辨率会受到影响,随即出现衍射伪影。

        获得适当对比度最古老的方法,首先可能就是对样本染色了。通常,只可能对无生命的材料进行染色,在有些情况下,还需要采取一些复杂的染色技术。如果用户想要观察活体细胞,那么,染色就会变得非常不易。因此,适当的光学显微镜就会提供不同的技术手段,目标是通过样本与光的相互作用改变相移,将相移转变成振幅移位。

        相衬和微分干涉相衬 (DIC) 就是上述相衬观察法的示例其他光学相衬观察法则包括暗场相衬观察法


        图 2a:横截面为兔子味蕾,相衬显微镜


        图 2b:微分干涉相衬观察显微镜


        图 2c:明场显微镜

        光与样本之间相互作用

        如果入射光能够穿透样本,则光线会与样本之间相互作用。吸收率、反射率、衍射率、光散射和折射率可能会受到影响。在上述过程中,穿透的光波将会发生改变。相移和振幅也可能发生改变。

        就这一点来说,用户能够区分出相位和振幅物体。在理想情况下,相位物体就是改变相位却不改变光波振幅的样本。在相衬观察法中,振幅物体只会影响振幅,而不会影响光线相位。扁平和未染色的细胞几乎能达到相位物体在可见光下的特性。由于上述细胞只会发生肉眼看不见的相移,因此,它们在明场显微镜检查中的对比度是非常低的。而振幅物体本身则会在明场显微镜检查中实现良好的成像效果。它们会降低振幅,随之降低穿过的光线强度。

        经过染色或自然着色的物体在明场中可以很好地展现。它们属于振幅物体。它们会削弱穿过的光线,随之降低波阵面的振幅。但是,它们并非理想型振幅物体。除了振幅以外,它们还是会影响射入光线的构成。它们还会吸收或反射不同频率的光波,然而,其他波长的光也会畅通无阻地穿过。

        由于样本和周围介质的折射率不同,因此,会发生相移。如果光波穿过细胞时会减速,而振幅不变。当光线离开细胞时,它会恢复原有的速度,然后跟先前一样,穿过频率、波长和振幅相同的介质。但是,与只穿过介质的光线相比,它的相位发生了移动。

        假设肉眼和其他检测器无法识别和检测光波的相移,那么,针对未染色和无色样本的相衬观察法的主要目标就是,生成振幅对比,并将相位对比转换成振幅对比。

        对生物研究的重大影响

        较之固定和染色的物体,使用未染色样本具有很多优势。通过这种方法,可以在生物显微镜下实现对未予以固定和染色的活体形态的观察。样本固定或染色会导致其发生收缩或膨胀现象。另外,还存在损坏细胞的不同结构,继而改变其形态的风险。消除上述风险的唯一保险的方式就是,使用不含伪影的活体样本,从而提供可靠、真实的信息。

        活体细胞显微镜检查的一大优势就是检测与时间相关的方案。除了获取细胞的静态信息及其状态的快照外,还能实现对其整个过程的监测,例如,细胞运动、细胞分裂和凋亡。由于完成上述过程需要大量的时间,因此,建议在光学显微镜系统中添加一台照相机用于在固定间隔时间以短片的形式进行记录。

        从不同光学相衬观察法中获取的信息和效果因其起源的不同而有所差异。因此,建议将不同相衬观察法组合起来加以使用,从而获取受测样本的最精确、最详尽的图像。但是,明场通常无法精确观察到细胞的形态,需要通过其他光学相衬观察法实现进一步观察。

        为细胞活像添加荧光标记后,可以获取更多信息。可以为细胞中感兴趣的蛋白部分添加荧光蛋白标记,例如GFP。可以通过光学显微图像追踪它的定位,并在细胞内部予以精确判定。还可以将 GFP 与缩氨酸定位信号进行耦合。通过这种方式可以观察到内质网等不同的隔室。

        研究中用到的现代化光学显微镜通常采用标准化设计,确保单一相衬观察法之间的快速切换,甚至同时使用。在实验室常规检查中,运用光学相衬观察法,能够轻松实现对活体细胞和无色样本的检测。

        本篇文章来源自徕卡显微系统,侵删

        所属类别: 应用支持

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