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徕卡共聚焦课堂:荧光寿命 | 一个适当的选择

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  • 发布时间:2022-04-18 11:04
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【概要描述】

徕卡共聚焦课堂:荧光寿命 | 一个适当的选择

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荧光成像远超您的想象

荧光过程提供了两个用于成像的测量参数:强度和荧光寿命。荧光寿命是指分子停留在激发态的时间。可以通过观察足够大量的激发-发射事件集合来测量荧光染料的典型寿命。我们可以测量图像中所有像素的典型寿命,并将这些数字记入数组元素。那就是荧光寿命成像(FLIM,也称为τ-映射)。典型的荧光寿命范围在0.2到20纳秒之间。

 

荧光寿命与荧光染料的浓度无关。无论样品结构仅有零星荧光染料还是载满荧光染料:寿命信号始终相同,并表明在同一环境中存在相同的荧光染料。因此,荧光寿命不受光漂白的影响。样品深处的图像将比表面图像暗得多——但寿命并没有改变。这是寿命测定的主要优势。

 

如果分子环境刺激激发态衰变而不发射光子,则荧光强度会降低(淬灭)。荧光淬灭是一条单独的发射路径,因此在动力学上与荧光过程形成竞争关系。激发态存储现在可以通过一个以上的过程衰变,从而缩短荧光寿命。这种寿命的改变可用于收集分子环境的信息。

 

FLIM-标准

FLIM的黄金标准是“时间相关单光子计数”TCSPC,它可以与共聚焦显微镜和多光子显微镜兼容。用脉冲激光照射样本,测量发射光子到达的时间。为获得典型寿命值,这种测量要在同一样本位置重复几次。需要测量几百个事件才能达到大约10%的准确度。然后将数据按时间分组放入直方图中。然后对该直方图中随时间出现的衰变进行数学拟合,并直接提供所需的荧光寿命(图01a-c)。

图01a:测量被脉冲激光激发(蓝色箭头)后发射光子(红色箭头)的到达时间t。此处绘制了5个测量值。

图01b:到达时间的直方图,包括上述示例中五个事件的集合。大多数计数#时间都很短。直方图用指数衰减(红色)来拟合。

图01c:拟合显示,例如,两个单衰变(蓝色和绿色曲线),衰变时间t和t,振幅为A和A。求和将再次获得红色衰变曲线。

这个过程是最精确的,并可以重复,但需要一定时间。测量后,系统在大约100纳秒的死区时间内准备好进行下一次发射。要录入400个事件,测量一个像素的时间达40微秒。一张512x512的图像大约需要12秒,这无法适应快速变化和运动的生命系统。

 

新标准

徕卡显微系统推出了一款新型FLIM显微镜:STELLARIS FALCON(FAst Lifetime CONtrast)荧光寿命成像系统可以解决以上所有问题。

 

本系统基于混合探测器(HyD),是理想的寿命成像传感器,具有极短的死区时间。激光脉冲序列和发射光子脉冲都以高采样率即刻实现数字化,将测得的距离直接输入数据池。这些到达时间用于输出“快速-FLIM”图像。

 

新方法可以使用大多数激光脉冲,并应用一个过滤器来限制只有一个光子发射的脉冲事件。在第一个光子到达后不久,随即到达的光子不可避免的会被忽略,可以通过智能数学方法进行校正。基于以上种种因素,图像记录速度提高了10倍。

 

所有FALCON FLIM成像均集成在共聚焦显微镜中。记录FLIM就像激活一个额外的通道。用于3D、时间和光谱系列的多维采集模式可立即用于FLIM成像。例如题图:具有经典组织学染色的小鼠胚胎。使用NAVIGATOR软件,拍摄了722个视野,每个视野为512x512像素的图片。原始图像有1.9亿像素。用四个指数对寿命进行拟合,并以颜色进行编码。

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